上海反转录

来源: 发布时间:2023-11-26

RNA逆转录实验注意事项:RNA定量:除了掌握RNA的完整性之外,反转录之前还需要对RNA浓度进行测定。一般反转录试剂盒会对上样量有要求,建议totalRNA上样量小于5μg。超过这个范围,会使反转录产物产生偏好性(表达丰度高的基因优先被反转录)而造成定量结果不准确。逆转录引物的选择:逆转录引物一般包含3种:oligodT引物,随机引物和特异性引物。对于短的且不具备发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可用。逆转录实验过程中避免光照,防止RNA样品和试剂受光降解或刺激。逆转录酶是逆转录过程中的重要酶类。上海反转录

逆转录过程由逆转录酶催化,此酶也称依赖RNA的DNA聚合酶(RDDP),即以RNA为模板催化DNA链的合成。合成的DNA链称为与RNA互补DNA(complementaryDNA,cDNA)。逆转录酶在生物界存在于逆转录病毒以及真核细胞(如端粒酶)中,拟逆转录病毒没有单独的逆转录酶,其DNA聚合酶带有逆转录酶的活性,可能与病毒的恶性转化有关。人类免疫缺陷病毒(HIV)就是一种逆转录病毒,含有逆转录酶。在小鼠及人的正常细胞和胚胎细胞中也有逆转录酶,例如端粒酶就是一种逆转录酶,推测可能与细胞分化和胚胎发育有关。上海反转录逆转录后的DNA可直接用于基因克隆或测序等应用。

人体中也有逆转录过程,比如端粒的复制。端粒(telomere)是染色体末端的特殊结构,由重复的DNA序列(TTAGGG)和核的蛋白组成,可以保护染色体末端,维持基因组完整性。端粒的末端是单链3'末端,形成一种紧凑的T环结构,可保持其稳定性。其表面覆盖着Shelterin复合物,包括TRF1(端粒重复结合因子1)、TRF2(端粒重复结合因子2)、TIN2(TRF1相互作用核的蛋白2)、RAP1(rif相关蛋白)、POT1(端粒保护)和TPP1(端粒保护蛋白1)成功将人表皮干细胞体外分离培养的基础上,对比观察不同发育阶段人表皮干细胞端粒酶反转录酶表达的差异特征,结果表明人胚胎、少儿、成人皮肤来源的表皮干细胞均有端粒酶反转录酶表达,其表达强度依次减弱。提示诱导和增强端粒酶反转录酶的表达对维持表皮干细胞在体外自我更新和增殖能力可能具有重要意义。

逆转录酶实验流程:从细胞材料中提取RNA→RNA加入到含有逆转录酶、引物、dNTPs的反应体系中→退火,引物与RNA链配对→延伸,逆转录酶合成互补cDNA链变性→常规PCR反应流程(变性、退火、延伸,如此多次循环)。RT-PCR“两步法”与“一步法”RT-PCR的实验操作分为“一步法”与“两步法”两种。一步法RT-PCR能克隆微量mRNA而不需构建cDNA文库(即cDNA合成与PCR反应在同一Buffer及酶中进行,一步法完成),省略了cDNA与PCR之间的过程。两步法RT-PCR首先用反转录酶合成cDNA,然后以cDNA为模板进行PCR,即RNA反转录与PCR扩增分两步进行。逆转录实验中可以通过qPCR检测逆转录反应效果。

逆转录酶是存在于RNA病毒体内的依赖RNA的DNA聚合酶。RT-PCR实验中的逆转录酶需要具有以下二种活性:依赖RNA的DNA聚合酶活性:以RNA为模板合成cDNA的首先条链。依赖DNA的DNA聚合酶活性:以一条DNA链为模板合成互补的双链DNA。在选择逆转录酶时,建议选择无RNaseH①活性(RNaseH-)的逆转录酶。具有RNaseH活性的逆转录酶的RNaseH活性会与聚合酶活性竞争RNA模板与DNA引物(或cDNA延伸链)形成的杂合链,并降解杂合链中的RNA链。被RNaseH活性所降解的RNA模板不能再作为合成cDNA的有效底物,降低了cDNA合成的产量与长度。逆转录实验中引物设计时要注意反向引物特异性和长度,避免循环扩增和特异性问题。上海反转录

逆转录后的DNA可用于构建基因工程载体。上海反转录

逆转录的发现有重要的理论意义和实践意义。(1)在致死病毒的研究中发现了病基因,在人类一些病细胞如膀胱病、小细胞肺病等细胞中,也分离出与病毒病基因相同的碱基序列,称为细胞病基因或原病基因。病基因的发现为疙瘩发病机理的研究提供了很有前途的线索。(2)在实际工作中有助于基因工程的实施。由于目的基因的转录产物易于制备,可将mRNA反向转录形成DNA用以获得目的基因。逆转录酶实验操作注意事项:RNA提取一定要迅速,样本要新鲜,组织尽量在液氮中研磨;RNA提取完马上进行逆转录不要拖延,新提的RNA很容易降解;逆转录反应过程,需建立无RNAase环境,以避免模板RNA降解。RNase是RNA水解酶的统称,包含RNaseA,RNaseH等,RNaseA可以水解单双链RNA,RNaseH主要水解RNA与DNA杂交双链中的RNA。上海反转录